肥胖抑制剂

肥胖抑制剂特异性表达于肌肉组织，属于TGF-β超家族，是调控肌肉生长和发育的最重要的负调控因子，并同多种疾病有关。为获得MSTN蛋白，制备多克隆抗体，深入了解MSTN基因的调控机理，将MSTN基因片段克隆入组氨酸标签融合的表达载体pET-30a-c(+)中，IPTG诱导，利用金属螯合亲和层析(MCAC)进行纯化，薄层扫描及Bradford法检测纯化蛋白的纯度与含量；免疫家兔制备多克隆抗体，利用间接ELISA法检测抗体效价，Western blotting印迹检测抗体特异性。经表达形式分析证明，融合蛋白大部分为包涵体，薄层扫描分析表明纯化蛋白纯度可达90％以上，Bradford法检测蛋白浓度约5㎎／ml。抗血清效价可达1:250000以上，Westernblotting印迹检测证明抗体特异性良好。结论：经诱导表达及纯化制备出纯度较高的MSTN蛋白产物，并获得高效价特异性良好的多克隆抗体。

MSTN由骨骼肌表达进入血液以后，以自分泌或旁分泌的方式作用于骨骼肌，抑制骨骼肌的发育，而阻断MSTN作用途径可以显著增强肌肉发育。为探讨利用重组MSTN蛋白阻断体内MSTN作用途径，增强肌肉发育的可能性，本研究在体外成功表达并纯化了MSTN蛋白的基础上，将纯化后的MSTN蛋白同佐剂充分混合后，免疫雌性昆明白小鼠。第三次加强免疫后第三天同雄鼠合笼。研究结果表明，免疫后对照组和实验组母鼠体重差异不显著；在妊娠后期，两组之间体重出现差异，而分娩后，这种差异消失。仔鼠出生重在两处理组中差异极显著，实验组仔鼠出生重较对照组增加25.8％左右，但在生长阶段，两组间体重差异有逐渐减少的趋势。结论：应用重组MSTN蛋白免疫母鼠可以显著提高初生仔鼠体重。

应用重组MSTN蛋白免疫小鼠可以诱导体内免疫反应，但由于MSTN在高等动物中高度保守，而且MSTN分子量较小，因而其抗原性也相应较弱。而乙肝核心抗原是重要的载体蛋白，具有很强的免疫原性，能以T细胞依赖和T细胞非依赖作用方式产生免疫反应，并显著增强其融合蛋白的抗原性。为进一步增强MSTN的抗原性，提高疫苗的免疫效果，本研究利用PCR方法获得了MSTN羧端片段，并将其分别与乙肝核心抗原的氨端、羧端或中间融合，构建了三个重组融合表达克隆：pET-30a-c(+)-SM／HBcAg(N)、pET-30a-c(+)-SM／HBcAg(C)和pET-30a-c(+)-SM／HBcAg(M)，并经IPTG诱导，在大肠杆菌BL21中实现了表达。利用金属螯合亲和层析(MCAE)进行纯化。本实验结果为进一步探讨MSTN同HBcAg的最佳融合位点，增强MSTN的免役原性奠定了基础。