Real Time Q-PCR

所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

原理

PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，DNA聚合酶的失活,dNTP和引物的枯竭，反映副产物焦磷酸对合成反应的阻害等原因，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。

在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。

为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值（threshold）是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline），荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数（Ct）。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

目的

（1）对起始模板进行定量；

（2）对某个基因进行快速／无污染的定性检测。

优点

（1）动力学范围较宽：可分析少量的样本，如临床活组织切片检查，可以检测少于5个拷贝的目标序列；

（2）用适当的内参物和计算方法，可使平均变异系数在I％一2％，在低水平的基因表达下也可分析基因表达的细微变化；

（3）自动化程度高；

（4）real-time PCR在封闭的容器中进行，减少了操作造成的污染。

缺点

（1）易受影响，如临床检验或法医鉴定一些体内的流体物质，其中会有抑制剂存在食物中的徽生物会被有机酚类抑制，一般选用适当的DNA聚台酶(如Tfl、Pwa、Tth等)，这些酶可以排除抑制剂的干扰；

（2）分析基因表达，RNA易降解，因此提取时要保证RNA 的完整性，尽可能除去核酸酶、基因组DNA、RT或PCR抑制剂的污染；

（3）采集、保存和运输都会影响RNA的品质；

（4）反转录过程也会使RNA变性。但是最主要的是人员操作，使用real-time PＣR分析基因表达，引物的设计必须严格遵循标准，确保结果的准确性。

应用前景

随着技术不断改进和发展，目前real-time Q-PCR已成为科研的主要工具，该技术未来的应用前景是令人鼓舞的，一方面real-time Q-PCR技术与其它分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA拷贝数成为可能。另一方面荧光标记核酸化学技术和寡核苷酸探针杂交技术的发展以及real-time Q-PCR技术的应用，使定量PCR技术有一个足够的基础为广大临床诊断实验室所接受，将有助于临床医生对疾病的诊断和治疗。其中最主要的应用集中在以下几个方面：

（1）DNA 或RNA 的绝对定量分析，包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等；

（2）基因表达差异分析。例如比较 经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证；

（3）基因分型，例如SNP检测，甲基化检测等。