Fas/FasL

Fas及其配体FasL是近年来研究得最为深入的有关细胞凋亡的膜表面分子，阐明它们在凋亡中作用机制，对深入了解细胞凋亡的机理起产生了深远的影响。

1. Fas与FasL的结构与分子生物学特征

2. Fas参与CTL细胞的杀伤机制

3. Fas介导淋巴细胞凋亡

4. Fas/FasL异常所引起的疾病

1. Fas与FasL的结构与分子生物学特征

1989年Yonehara等发现了一株单克隆抗体，这株抗体可以识别一种表达于髓样细胞、T淋巴细胞和成纤维细胞表面的未知分子，诱导多种人细胞系发生凋亡，这种新的膜分子被称为Fas。同年，Trauth等也发现了一株可以诱导活化或恶性变淋巴细胞凋亡的单克隆抗体，他们将这株抗体所识别的蛋白称为凋亡蛋白-1(Apo-1)。基因克隆证明， Fas和Apo-1是同一种蛋白。Fas/Apo-1是I型跨膜糖蛋白，其蛋白前体长335aa，N端有16个疏水性氨基酸组成的信号肽，成熟蛋白长319aa。胞膜外区(157aa)有3个CRD，其中有2个N-糖基化位点。跨膜区有17个疏水性氨基酸。胞浆区长145aa，其中有24个碱性氨基酸和19个酸性氨基酸。根据氨基酸序列推测Fas的分子量为36kDa，由于糖基化的影响，实际分子量约43kDa。

对Fas胞浆区氨基酸序列的比较发现，它与TNFRI有一段68aa的同源序列，这段序列对Fas和TNFRI所介导的细胞凋亡起着决定性的作用，用基因突变的方法将同源区进行改造后，它们就丧失了致凋亡的能力，所以这一同源区被命名为死亡结构域。以后的研究发现，死亡结构域也存在于其它死亡受体以及一些胞浆内信号转导蛋白，受体的死亡结构域可以与胞浆信号蛋白的死亡结构域发生同源或异源结合，所以这个结构域的作用是作为一个接头将死亡受体与胞浆信号通路联系起来。

在Fas的C端有15aa对死亡结构域的作用可能有抑制功能，将这15aa突变掉之后，Fas诱导细胞凋亡的作用得以增强。这一结构域在其它死亡受体尚未发现，但其它受体能通过各自独特途径，对死亡信号进行反馈调节。

人Fas基因定位于10号染色体长臂，小鼠Fas基因位于19号染色体，各包含9个外显子。胞浆中有两种不同长度的Fas mRNA，一种编码全长分子，另一个编码可溶性分子。Fas表达比较广泛，小鼠的胸腺、心脏、肝、肺、肾和卵巢等都有表达，在胸腺中除CD4-CD8-的双阴性细胞外，其它所有细胞都表达Fas。但在人的胸腺细胞中，Fas只有很微弱的表达，而在活化淋巴细胞和HTLV-1、HIV、EBV等病毒感染的淋巴细胞中高表达。IFN-g 和TNF-a 可以增强Fas的在多种细胞中的表达，从而增强Fas介导的细胞凋亡。

Fas的配体FasL于1993年由Suda等从CTL杂交瘤衍生的细胞系PC60-d10S细胞系中克隆成功，FasL长278aa，为II型跨膜糖蛋白，由胞膜外区(179aa)、跨膜区(22aa)和胞浆区(77aa)组成，N端150个氨基酸为TNF超家族同源区，同源性主要表现在形成b 折叠股的序列，在b 折叠股c和d之间有一对保守的二硫键，对其空间结构的形成有作用。FasL在胞膜外区有4个N-糖基化位点，经过糖基化的FasL的分子量为36-43kD。FasL的胞浆区富含脯氨酸。

FasL基因位于1号染色体，与OX-40L基因相邻，由5个外显子组成。FasL只表达于活化T淋巴细胞，其它细胞如B细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及胸腺细胞都不表达FasL，但在小鼠的睾丸组织中，却可见到高表达的FasL。佛波酯(PMA)和离子霉素可以促进FasL表达，环孢素A可以抑制FasL的表达。

2. Fas参与CTL细胞的杀伤机制

在Fas/FasL发现以前， 一般认为CTL细胞的杀伤作用是通过穿孔素(perforin)和颗粒酶(granzyme)实现的，穿孔素在Ca2+存在的条件下可以插入靶细胞膜，并多聚化形成管状结构，破坏靶细胞膜的结构。而颗粒酶是一类丝氨酸酯酶，进入胞浆后可以直接活化胞浆中的蛋白酶，使细胞发生凋亡。穿孔素和颗粒酶的作用是Ca2+依赖的。但实验发现，在没有Ca2+存在的情况下，活化的CTL细胞系PC60-d10S仍然可以杀伤靶细胞。进一步的研究证明，这个细胞系是通过Fas/FasL实现其Ca2+非依赖性杀伤作用的。所以CTL细胞在活化后，可以通过两条互不相关的途径杀伤靶细胞：一方面，分泌穿孔素和颗粒酶，以Ca2+依赖的方式作用于靶细胞膜，杀伤靶细胞；另一方面，在CTL细胞识别靶细胞后，细胞表面表达的高水平FasL与靶细胞表面的Fas相互识别，通过Fas触发靶细胞内部的凋亡程序，使靶细胞发生程序性细胞死亡。CTL细胞的这两条杀伤机制是相互独立的，因为穿孔素基因敲除的小鼠，以及不表达穿孔素的CTL细胞系，都具有正常的Fas/FasL依赖的杀伤功能；而在Fas/FasL系统突变性疾病的小鼠中，穿孔素/颗粒酶杀伤机制仍是健全的。

CD4+的TH1和TH2细胞也可以通过Fas/FasL机制杀伤细胞，一般来说，TH1细胞的杀伤活性要高于TH2细胞。

3. Fas介导淋巴细胞凋亡

在淋巴细胞的生活周期中，不同阶段的T细胞和B细胞都会发生正常的死亡。前T细胞在胸腺中要经过阳性选择和阴性选择， 95%的前T细胞发生程序性细胞死亡，只有5%可以成熟进入外周血。进入外周血的T细胞还要经过外周克隆剔除(peripheral clonal deletion)的选择过程，进一步剔除能与外周组织表达的自身抗原发生反应的T细胞。另外，当活化T细胞与外来抗原反应后，机体也存在着清除机制杀伤这些细胞，以免大量活化的T细胞在外周堆积，影响免疫系统的功能的稳定和平衡。

在两种Fas/FasL突变导致的疾病lpr和gld小鼠中胸腺的阳性选择和阴性选择是正常的，说明Fas可能不参与胸腺中的阳性和阴性选择。但在这些小鼠中，外周克隆剔除和活化T细胞的清除发生了障碍，T细胞可以在外来抗原的刺激下发生正常的活化和增殖，但却不能在完成使命之后被有效清除掉，这些小鼠常伴有自身免疫性疾病的发生。这说明Fas既参与了外周淋巴器官中自身反应性淋巴细胞克隆的剔除，又参与了对外来抗原反应过的活化T细胞的清除。

Fas是通过活化诱导的细胞死亡(activation induced cell death, AICD)作用参与外周克隆剔除和活化T细胞的清除的。在TCR的诱导下，T细胞一方面被活化，另一方面被诱导表达Fas和FasL。相邻的活化T淋巴细胞的Fas和FasL相互作用可以彼此杀伤，活化T细胞表面Fas/FasL相互作用也可导致直接自杀。另外，FasL还可以从细胞膜表面脱落下来，形成可溶性配体分子，这些可溶性分子可以自分泌和旁分泌的方式，作用于自身细胞和邻近活化T细胞，分别进行自分泌杀伤和旁分泌杀伤。

当Fas系统功能发生障碍时，活化的T细胞就会堆积在体内，引起自身免疫性疾病。但在幼年的lpr和gld小鼠，活化T细胞的堆积并不明显。研究认为，在幼年动物中可能还有其它机制参与活化T细胞的清除。这种机制可能随着动物的成年而消失或减弱，所以在成年动物表现出比较明显的活化淋巴细胞的堆积。

B细胞在其发育的一定阶段也可能发生凋亡，在骨髓发育中，那些对自身抗原表现强反应的细胞通过一些不依赖于Fas的机制被清除。迁移到外周淋巴器官的B细胞，在被抗原活化后，细胞表面的Fas表达水平也明显升高，这有可能使活化B细胞表面的Fas通过与CTL细胞表面的FasL的结合而被杀伤。在lpr和gld小鼠中，由于Fas/FasL机制受阻，使活化的B细胞在体内堆积，产生大量的免疫球蛋白，其中也包括自身反应性抗体，这也是这些小鼠发生自身免疫性疾病的主要原因。

4. Fas/FasL异常所引起的疾病

小鼠天然突变性疾病lpr(lymphoproliferation)和gld(generalized lymphorpoliferative disease)的突变分别发生于小鼠19号和1号常染色体。lpr和gld小鼠分别出现淋巴结病和脾肿大，产生大量IgG和IgM，其中包括抗DNA抗体和风湿因子。动物在出生5个月后出现免疫复合物型肾炎和关节炎。lpr和gld小鼠明显的特征是出现大量自身反应性CD4+T细胞，能辅助B细胞产生抗体，而不出现AICD。

(1)小鼠lpr：虽然lpr与gld不是等位基因的突变，但它们的表现却极为相似。1991年，Allen等通过一系列骨髓移植实验，证明lpr和gld是编码一对互为配体/受体的蛋白的基因的突变引起的。对lpr小鼠Fas基因的分析发现，一个长约5.7kb的反转座子ETn插入到Fas基因的第二个内含子。这个ETn在长末端重复序列(LTR)中带有一个多聚腺苷酸信号(AATAAA)，引起Fas基因的异常剪接和提前终止。在lpr小鼠肝脏和胸腺只有非常少的Fas mRNA，而且往往成熟mRNA中只有外显子1和2，不能编码正常Fas蛋白。

在另一种基因突变lprcg(complements gld)小鼠，Fas基因的长度和表达水平是正常的，但这个mRNA在胞浆区有一个T→A的点突变，使死亡结构域的225位异亮氨酸突变成了天门冬酰胺，Fas失去了转导信号的功能，这种小鼠也表现出与lpr小鼠相似的症状。

(2)小鼠gld：研究也证明，gld小鼠的病变发生在FasL基因，其C端编码区有一个点突变，使胞膜外区与Fas结合部位的一个苯丙氨酸变成了亮氨酸，使之不能与Fas结合，从而失去了功能。

无论是lpr还是gld，其结果都是使Fas与FasL不能结合，或不能转导凋亡信号，也就使外周T细胞和B细胞不能发生细胞凋亡，这样，大量的淋巴细胞可能进入并聚集在淋巴结和脾脏，产生了淋巴结病和脾肿大；而众多自反应性CD4+T细胞辅助自反应性B细胞产生大量自身抗体，形成了致命的免疫复合物性肾炎和关节炎。

(3)人类类似lpr和gld疾病：在人类，也有类似于lpr和gld小鼠的症状的报道。三位患者都是儿童，均出现淋巴结病和脾肿大，幼年发生自身免疫症状。研究证明，他们的Fas基因不同程度地发生了基因缺失，不能表达全长的Fas蛋白。

另一方面，当Fas功能过度增强时，也可以引起疾病。在人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)时，在HIV感染的CD4+T细胞表面有高表达的Fas，这些T细胞易于被CTL细胞所杀伤，这是AIDS导致T细胞功能低下的原因之一。