DNA片段的体外连接技术_在线百科全书查询
DNA片段的体外连接技术
掌握DNA片段的体外连接技术。
DNA连接酶：
能催化双链DNA片段紧靠在一起的5’-P末端和3’-OH末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。
E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
1、E.coli DNA连接酶：
由E.coli基因lig编码，需烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作为辅助因子。
修复双链DNA上的单链缺刻(nick)，用于连接匹配粘端。
2、T4 DNA连接酶：
从T4噬菌体感染的E.coli中分离得到，由T4基因DNA30编码，需ATP作为辅助因子。
修复双链DNA上的单链缺刻(nick)，用于连接匹配粘端；
连接RNA-DNA杂交双链上DNA链缺刻；
连接平端双链DNA分子。
1、修复双链DNA上的单链缺刻，用于连接匹配粘端。
带匹配粘端的DNA分子靠近时，自发形成暂时的碱基配对，利于连接酶把紧邻的5’-P与3’-OH连接到一起。
不同DNA片断通过匹配粘端的连接。
同一DNA片断通过匹配粘端的连接--自身环化。
2、连接RNA-DNA杂交双链中DNA链上的缺刻。
3、连接带平端的双链DNA分子。
注意：
DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接；
只能连接双链DNA分子的单链缺刻(nick)；
不能连接双链中1个或多个核苷酸缺失所致的缺口(gap)。
E.coli DNA连接酶：连接匹配粘端；
T4 DNA连接酶：连接匹配粘端、平端。
最常用的为T4 DNA连接酶。
匹配粘端的连接：
1）哪些情况下会产生匹配粘端？
同一限制酶切割产生；
同尾酶切割产生。
2）可以用E.coli DNA连接酶、也可以用T4 DNA连接酶。
3）连接效率高。
4）连接后的情况如何？
同一限制酶切割的DNA片段，连接后仍保留该限制酶的识别序列。
两种同尾酶切割的DNA片段，连接后丧失这两种限制酶的识别序列。
平端的连接：
1）哪些情况下会产生平端？
限制酶切割产生；
RNA逆转录合成的cDNA为平端双链；
PCR扩增也能产生，如用Pfu扩增时。
2）只能用T4 DNA连接酶。
3）连接效率低，仅为粘端的1%。
4）连接后的情况如何？
同一限制酶切割的DNA片段，连接后仍保留该限制酶的识别序列，有时还出现另一种新的限制酶识别序列。
不同限制酶切割的DNA片段，连接后丧失这两种限制酶的识别序列。
提高平端连接效率的方法
加大连接酶用量(10倍于粘端连接，1-2U)；
加大平端DNA片段的浓度；
加入10% PEG 8000；
加入单价阳离子(NaCl)，终浓度150-200 mM。
