DNA连接技术

[原理]

[操作]

［试剂与器材］

[原理]

利用DNA连接酶把载体DNA和要克隆的目的DNA片段连接在一起，成为一个完整的重组分子，这就是分子克隆中常说的连接反应。当载体DNA和外源DNA末端都是由一种产生粘性末端的内切酶切割产生的话（同尾酶也可以），或者两者末端被接上一段互补的多聚体的尾巴，那么经退火后可形成新的重组分子。连接后产生的重组分子中仍然保留着外源DNA两端的限制性内切酶切点，从而使我们能方便地从重组分子再次取出所克隆的DNa段。

[操作]

（1）取 3支eppendorf离心管，标上1、2、3号。

（2）按下表依次加水、V-DNA，在 2，3号管加 P-DNA。

（3）离心3秒，置 65℃保温 10分钟，然后取出插入冰中。

（4）用T4 DNA连接酶稀释液把T4 DNA连接酶稀释至0.2 U／ml。

（5）按表中所示的量加入10×缓冲液，在1及3中加连接酶。

（6）混匀，离心3秒钟，置12℃恒温水浴过夜。次日取出，如不做转染放-20℃保存。2和1为对照，以检查V-DNA的酶切效果和连接酶连接效果。

现在宝灵曼公司已推出快速连结DNA试剂盒。该试剂盒能在室温下5分钟内将粘性末端或平头末端片段连接。进行反应需要的所有试剂已包括在试剂盒内。

［试剂与器材］

l．试剂

（l）载体DNA(V-DNA): M12mp19RF DNA，经BamHI切割,分子量约7.2kb，浓度约lμl＝10 ng。

（2）外源DNA(P-DNA): AcNPV变株m29DNA的BamHI切割产生的F片段，分子量约1.9 kb，浓度1μl=5ng。

（3）10×连接反应液：700 mmol／L Tris-HCl，pH7.5，70mmol／L MgCl2，0.7mmol／L ATP。

（4）T4 DNA连接酶稀释液：50mmol／L Tris-Cl，pH7.5，500μg/ml BSA（牛血清白蛋白）。

2. 器材 恒温水浴器。