球形芽孢杆菌

编　号 Strain Number AS 1.270

拉丁学名 Latin Name Bacillus sphaericus Meyer and Neide

中文菌名 Chinese Name 球形芽孢杆菌

拉丁别名 Other Strain Name

菌株来源 History ← Chen qi S67

分离基物 Habitat

参考文献 reference

用　途 Usage

培养温度 Temperature 30 C

培 养 基 Media Number 2

备　注 Note

一、简介

苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bti)和球形芽孢杆菌(Bs)是目前应用最广、使用最成功的灭蚊病原微生物，其灭蚊选择性强，对非靶生物和人畜无毒性，在自然界中易降解不污染环境。养殖场灭蚊范围广，排污量大，积水容器多，易孳生多种蚊类，使用Bti制剂和Bs制剂具有施药方便、作用范围广等优点，能有效控制蚊虫的孳生。

二、比较

球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus，Bs) 与苏云金芽孢杆菌相比较，球形芽孢杆菌的杀蚊谱较窄，其中对库蚊属幼虫的毒性最强，在污水中的药效维持时间较长，特别适用于污水中孳生的库蚊属幼虫(淡色库蚊和致倦库蚊)的控制。Bs制剂主要有Bsc3—4l、Bs一2362、Bs一10等。Bs制剂较Bti制剂易产生抗性，但实验证明，对Bs产生抗性的蚊幼虫对Bti却仍然表现出高度敏感性。因此，可以利用这一点，联合使用两种制剂，产生协同作用，扩大杀蚊谱，延长药物维持时间，提高杀灭疗效，并预防或延缓蚊幼虫对Bs产生抗性。另外，随着分子生物学技术的发展和应用，也使用包含了Bs的二元蛋白 BsB和Bti的四个蛋白(Cry4A，Cry4B，CryllA和 CytlA)的重组菌株，或者包含了Bs一2362和Bti两种菌株的杀蚊毒素的重组菌株用于蚊虫控制，经过实验证实，可扩大杀蚊谱，药效延长至7—2l天，控蚊效果大大提高。

三、球形芽孢杆菌的特性

球形芽孢杆菌是一种在自然界中广泛分布、形成亚末端膨大孢子囊和球形芽孢的好气芽孢杆菌。在已发现的49个鞭毛血清型中有9个血清型(H1、H2、H3、H5、H6、H9、H25、H26和H48)的菌株对蚊幼虫有一定的毒杀作用。其中大部分高毒力菌株属血清型H5、H6和H25，如2362、1593、2297、Ts-1和C3-41等［6～11］。根据其杀蚊活性，这些菌株分为高毒力菌株和低毒力菌株，所有有毒菌株都具有较高的DNA同源性（>79%），属DNA同源型IIA型。

四、杀蚊毒素蛋白

球形芽孢杆菌对不同蚊幼虫的毒杀作用主要是由其产生的毒素蛋白实现的。现已证明在其生长发育过程中能产生两类不同毒素蛋白，一类是存在于所有高毒力菌株中的晶体毒素蛋白；另一类是存在于低毒力菌株中部分高毒力菌株中的Mtx毒素蛋白。

4.1　晶体毒素

所有高毒力和部分中毒力菌株（如LP1-G）在其芽孢形成过程中能形成位于芽孢孢外膜内的伴孢晶体。该晶体是有等量的51.4和41.9kD多肽（记为P51和P42）组成。P51和P42合成于细菌芽孢形成期，并在芽孢形成Ⅲ期通过两蛋白的相互作用和折叠而组装形成晶体［4,15］。P51和P42的同时存在是形成伴孢晶体所必需的。在B.　subtilis、Bs和Bti重组子中单独表达形成的P51和P42只能以无定形包含物形式存在；只有两种蛋白同时表达，才能形成典型的伴孢晶体；但两种蛋白在B.　subtilis重组子中同时表达只能形成无晶体结构的卵圆形和圆形的包含物，而只有缺失两结构基因间的核苷酸序列的融合基因才能表达形成晶体。这说明在Bs和Bti中含有促使蛋白稳定和晶体化的因子［17～18］。

Western Blot表明P51和P42蛋白间无交叉反应，说明它们之间无较强的同源性。但P51和P42在25%（90个氨基酸）位置上的氨基酸是完全相同的，其中，有4个区域的氨基酸性序列有高度的保守性，这些保守区域在两蛋白中的功能各不相同，可能同毒素蛋白的杀蚊活性相关。

4.2 Mtx毒素

目前在SSII-1、Kellen Q和2173等低毒力菌株及部分高毒力菌株中发现Mtx毒素［6,27～30］。这些毒素的合成同芽孢的形成不相关，它合成于细菌的营养体生长阶段。mtx的启动子同LacZ的融合实验也表明该毒素营养体时期表达［31］。同晶体毒素相比，Mtx毒素相对不稳定，热处理、反复的冻熔都会严重影响其杀蚊活性。DNA杂交实验证明所有的Mtx毒素同晶体毒素无同源性。

Mtx1毒素：Mtx1毒素是一种100kD的可溶性毒素（记为P100），由870个氨基酸组成。它的N-末端有一个具有G+细菌信号肽特征的序列，与ADP-核糖基转移酶催化亚基同源；C-末端有三个约90个氨基酸末端重复序列。这种P100可以通过去掉N-末端信号肽形成97 kD蛋白，也可被蚊幼虫中肠蛋白酶降解形成27和70kD的蛋白多肽，其中27kD含有一个同转膜序列相对应的区域，而且同几种ADP-核糖转移酶毒素有弱的同源性［32］。而且缺失实验也证明，27kD片段能自身ADP-核糖基化，70kD片段能使蚊细胞发生病理反应，只有两种蛋白片段的同时存在，才对蚊幼虫表现出毒性［32,33］。纯化的Mtx毒素同晶体毒素的杀蚊活性相当（LC50值15　ng/mL)，但由于这种毒素合成于营养体生长阶段，不能形成晶体，易被细菌生长过程中产生的蛋白酶降解形成无活性的多肽成分［34］。

Mtx2毒素、Mtx3毒素：Mtx2毒素和Mtx3毒素都是从SSII-1菌株中分离出的由292和326个氨基酸组成，分子量分别为31.8和35.8kD的毒素蛋白，它们同P100毒素和晶体毒素无同源性，而同产气夹膜羧菌Clostridium perfrigens的33kD的ε-毒素及绿浓杆菌Pseudomonas aeruginos的31.68kD细胞毒素有同源性［27,29］。Mtx2和Mtx3间有38%的同源性，都含有一个G+细菌的信号肽和假定的转膜区。对从6个不同Bs有毒菌株中分离的Mtx2比较分析，其氨基酸序列只有几个氨基酸差异，对蚊幼虫的毒性和杀蚊谱也有差异，其中224位置的氨基酸决定了该毒素杀蚊活性和杀蚊谱［35］。

4.3　毒素蛋白的作用方式

Charles利用电镜详细研究了蚊幼虫取食孢晶混合物后中肠上皮细胞的形态学变化，在敏感的尖音库蚊中，首先在胃盲囊和中肠后部出现电子密度低的区域，细胞形成空泡，线粒体膨大，但并未发现中肠细胞的裂解［36,37］。

蚊幼虫取食孢晶混合物后，晶体在中肠碱性环境和蛋白酶的作用下迅速溶解，释放出51.4和41.9kD毒素蛋白，然后进一步降解形成43和39kD的活性蛋白多肽［38,39］。在敏感和非敏感蚊幼虫体内，晶体蛋白都能被溶解和激活，因此晶体蛋白对不同蚊幼虫的毒性差异并不是由于晶体蛋白的溶解和激活方面的差异造成的［6,39］。

用荧光素标记的不同毒素蛋白成分研究了晶体毒素在蚊幼中肠上皮细胞的结合部位［18,40］。P51不能结合到伊蚊中肠上，P42只对整个中肠进行较弱的结合；对于致倦库蚊幼虫，只有P51能结合到中肠部位，而P42只对整个中肠进行非特异性的结合，只有在P51存在的情况下，P42才能特异性结合到胃盲囊和中肠后部。同时缺失实验而表明P51的N-末端和C-末端及P42的C-末端氨基酸对二元毒素同中肠的特异性结合起着重要的作用［18,41］。根据这些体内和体外的特异性结合实验结果，提出这样一种假设，即P51的N-末端区域同蚊幼虫中肠上皮细胞特定区域结合，其C-末端同P42的N-末端区域相互作用，使P42也结合到相同的部位而发生毒杀作用。目前还不清楚二元毒素结合到中肠上皮细胞后的详细作用机理。有人认为二元毒素通过内摄作用而进入细胞内发挥毒性［40,41］，或停留在膜上由P42在细胞膜上形成微孔导致胞内水分外流［6］。用125I-标记的活化毒素蛋白同敏感和非敏感中肠上皮细胞膜分离物（BBMF）的特异性结合实验证明了敏感蚊幼虫中肠中晶体毒素蛋白特异性结合位点的存在［6,41,42］。证明二元毒素蛋白同敏感蚊幼虫的BBMF中的单一类结合位点相结合，但未发现晶体毒素同伊蚊BBMF的特异性结合，这同荧光标记毒素的研究结果相同。晶体毒素的两组分都能结合到敏感蚊幼虫的BBMF上，但Scatchard线性分析却证明只有一种组分能结合到位点上，这同上面提出的二元毒素作用机理假设相符合。结合单独P42和P51对BBMF的特异性结合实验结果和其对蚊幼虫的生物测定结果，一般认为在晶体毒素中，P42决定毒素的杀蚊活性和特异性，P51同蚊幼虫中肠敏感位点的特异性结合，只有两种蛋白组分的协同作用才会表现出毒性，晶体毒素是一种二元毒素。

目前，人们试图分离出蚊幼中肠上皮的结合位点，但一直未成功，有关结合位点的特性不详，只证明糖类物质并不能抑制二元毒素同其结合［42］。

对几类Mtx毒素的作用机理并未进行详细研究，只对P100作用机理进行了一些初步研究。敏感蚊幼虫取食P100蛋白和二元毒素蛋白后的病理变化相差很大，说明两者存在着完全不同的作用机理。如前所述，P100毒素同Bt的δ-内毒素和其它杀虫毒素都无同源性，其N-末端存在的假定的转膜区对其毒性的实现是必需的，而去掉信号肽序列的97kD多肽同样对蚊幼虫有毒，说明信号肽是非必需的［30,32］。

由于P100毒素同百日咳，白喉和霍乱毒素有相同的氨基酸基元(Motif)。而这些毒素都是通过对蛋白质的ADP-核糖基化而发生作用。因此，P100蛋白也可能同ADP-核糖基化有关。在胰蛋酶和蚊幼虫中肠蛋白酶的作用下，P100蛋白可以降解为27kD的N末端和70kD的C-末端两个片段。27kD能使库蚊幼虫细胞抽提液中的38和42kD蛋白核糖基化；而70kD和97kD（P100缺失N-末端非必需的信号序列）的片段可导致蚊幼虫细胞系发生明显的病理学变化，但70kD片段缺少ADP-核糖基酶活性。因此，P100蛋白有两个功能区：C-末端可导致蚊幼虫细胞发生病理学变化，N-末端具有ADP-核糖基化活性［33］。

Mtx2和Mtx3同产气甲膜杆菌的毒素和绿浓杆菌细胞毒素有同源性，因此认为这两种Mtx毒素可能同细胞上的微孔形成有关。

参考文献(References)