胞外转录反应

由于RNA聚合酶一般由数个次单元组合而成，早先要在试管内应用RNA聚合酶的转录活性合成RNA并非易事，但这个问题在SP6, T3 及T7 等噬菌体的RNA聚合酶陆续被发现以后，情况已完全改观。这主要是因为这类RNA聚合酶由一条多胜肽 （polypeptides） 所构成，其在进行转录反应时所须辨认的启动子长度仅20bp左右，而且转录起始位置非常明确，转录效能良好，成了目前进行胞外转录反应时的最佳选择。要进行胞外转录反应时，仅需将目标基因次选殖 （subclone）至带有SP6, T3 或T7 启动子的转录载体，或者运用PCR技术在基因的一端加上SP6, T3 或T7 启动子的序列，即可运用对应的RNA聚合酶活性在试管内合成正意股或反意股RNA. 以质体DNA为模版进行胞外转录反应前，应先用限制酶自目标基因的一端切开，以免转录反应持续进行至载体的序列 （run-on），但在选择限制酶切位时应避免使用目标基因也带有的切位；限制酶内切好的质体DNA经phenol/chloroform萃取的后，即可用来进行胞外转录反应。